1、背景

口蹄疫病毒（FMDV）导致口蹄疫（FMD），这是一种高度传染性疾病的口 蹄疫动物。FMDV是一种单链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科的蚜虫病毒属，有7个血清型，A,O,C,Asia1、SAT-1、SAT-2和SAT-3型。根据国际传染病办公室（OIE）的统计，FMD已经影响了全球77%的牲畜。FMD的爆发给造成了巨大的经济损失。根据这些报告，长期受FMDV影响的动物的产奶量总体下降了80%。此外，即使在接种疫苗后，治愈的动物仍然携带该病毒。因此，开发一种快速、灵敏、准确的FMDV检测方法是十分迫切的手段。

2、RT-ERA结合CRISPR/Cpf检测FMDV的实验原理

首先，从样本中提取FMDV病毒中的RNA（第S1节）。然后，RT-ERA将RNA转化为DNA，并同时扩增DNA数百万次。与60℃的RT-LAMP相比，RT-ERA在37℃处具有较高的扩增能力。最后，RT-ERA的产物触发了反式裂解活性将Cpf1剪切ssDNA报告基因，实现第二次信号放大。ssDNA报告基因在两端修饰FAM和BHQ1，用于荧光检测。一种物质会导致Cpf1切割几个ssDNA报告基因，从而导致多种荧光。由于crRNA可以与产物特异性配对，CRISPR/Cpf1通过非特异性扩增来减少假阳性。

FAM和生物素被标记在LFA报告基因的两端。 在液体流动过程中，LFA-报告基因的FAM端通过FAM和抗FAM抗体之间的亲和力与AuNPs结合。当液体流入C线时，完整的LFA-报告基因被链霉亲和素和生 物素之间的亲和力所捕获。而用FAM端的Cpf1切割的报告者在t线上被阻塞。 因此，当FMDV存在时，在T线上有一个红色条带。而当FMDV不存在时，C线上 只有一个红色条带。重要的是，结果的输出只需要两分钟。因此，该方法充 分利用LFA，实现了灵敏和视觉的检测。

3、实验效果展示

对引物和2对crRNA筛选RT-ERA和CRISPR/Cpf1检测。P1、P2和P3分别代表三组不同的引物。(a)凝胶电泳用于RT-ERA引物的筛选；(b)、(c)和(d)荧光光谱，荧光图像和LFA筛选CRISPR/ Cpf1检测的crRNA。

4、CRISPR/Cpf1检测方法的优化

在5 min (a)下收集荧光强度，收集Cpf1的浓度；(b)收集crRNA的浓度；(c)收集ssDNA报告基因的浓度。

5、RT-ERA联合CRISPR/Cpf1检测的特异性

采用RT-ERA结合CRISPR/Cpf1检测到3种畜牧业中常见的FMDV和7种病毒。(a)荧光强度；(b)RT-qPCR特异性检测结果；(c)荧光图像；(d) LFA结果。

6、基于RT-ERA和CRISPR/Cpf1的方法检测FMDV的灵敏度

(a)不同浓度的1copies/μL^{− 1}到10 ⁷ copies/μL− 1；不同浓度FMDV的(b) LFA结果；(c)荧光图像。最后结论：该方法是一种灵敏、快速的FMDV检测方法。更重要的是，这种方法操作简单，不需要昂贵的仪器。此外，这些结果也很容易被解释。

7、采用RT-ERA结合CRISPR/Cpf1检测法检测实际样品

为了探讨该方法在真实样本（RS）中的能力，研究团队使用10份PBS和10份含核酸的血清样本进行RT/Cpf1ERA，编号为RS1-RS10和RS11-RS20。结果显示：图中7份PBS标本RS1~RS7PS阳性，3份RS8、RS9、RS10阴性。这说明基于RT-ERA结合CRISPR/Cpf1的方法具有较高的准确性，在实际样品检测中具有很大的潜力。

图注：(a)血清样本中，RS11~RS17阳性样本7份，阴性样本3例，分别为RS18、RS19、 RS20。（b)图中的荧光图像中也可以看到同样的结果。图中有5个(c)和(d)和LFA5(e)和(f)。为了确定结果的准确性，研究采用RT-qPCR作为检测样品的标准方法，其中S4、S5、7例PBS和7例血清均为阳性，3例PBS和3例血清均为阴性。计算结果与该方法的计算结果一致，表明该方法具有较好的计算精度。

本研究开发了一种基于RT-ERA和CRISPR/Cpf1的方法，实现了对FMDV的快速、灵敏检测。它比其他检测方法（如琼脂糖凝胶电泳和 RT-qPCR）更灵敏。该方法在实际样品检测中表现出良好的性能，其检测时间短、灵敏度高、成本低、无需大型仪器等优点提高了该方法的适用性，促进了该方法的推广。此外，该方法具有可编程性，通过改变引物和crRNA序列，可应用于其他RNA病毒的检测。因此，基于RT-ERA和CRISPR/Cpf1的方法不仅为FMDV检测提供了实用工具，也为RNA病毒的检测提供了一种新方法。