背景介绍：

为了提高等温扩增的特异性并打破平台期，本文发明了一种高信号一管嵌套RPA（ONRPA），并采用CRISPR/Cas12a作为终端输出，用于检测和鉴定牛结节性皮肤病病毒（LSDV）。ONRPA由两对嵌套引物系统组成，可持续扩增目标物。内引物位于外引物产物的内部。换句话说，外引物的产物是内引物二次扩增的模板。这种方法打破了扩增的平台期，通过在二次扩增中加入扩增材料，大大提高了灵敏度。此外，通过用两对引物识别目标区域，ONRPA显着提高了特异性。单管反应还简化了操作步骤和减少了污染的可能性。本文的方法通过最小化的便携式荧光计来收集信号，为农民和检疫人员提供了基于ONRPA和CRISPR/Cas12a 的可靠、灵敏且易于使用的方法。

图文解析

ONRPA 与 CRISPR/Cas12a 结合进行 LSDV 检测的原理：

ONRPA 基于连续两次放大。针对LSDV的VARV B22R基因设计两对引物，内引物位于外引物扩增的区域内。外引物与第一次扩增的靶标配对，如图1所示，产生大量产物可以与两对引物匹配，而非特异性扩增产物不能与内部引物匹配。此外，ONRPA 通过将内底漆系统和外底漆系统分别装载到管的底部和盖子上，消除了打开盖子以补充系统的中间步骤。这减少了污染的可能性并使过程更加方便。

CRISPR/Cas12a 系统显着提高了灵敏度和特异性。crRNA 旨在靶向 ONRPA 产品的中心域。当crRNA识别产物时，Cas12a的反式切割活性被激活，产生强烈的荧光信号。该方法具有极高的灵敏度和特异性，可以完全消除由于灵敏度低而导致的假阴性和非特异性扩增导致的假阳性。

ONRPA与CRISPR/Cas12a相结合的性能测试

图注：浓度为2.169×10³copies·μL⁻¹和2.169×10¹copies·μL⁻¹时，outer-RPA、inner-RPA、mix-RPA和ONRPA的比较。(A,C)荧光光谱。(B,D)荧光强度与时间之间的一阶导数结果。+和-分别代表测试和控制实验。实验进行了三次

图注:（A，B）ONRPA和常规RPA结合CRISPR/Cas12a的方案。（C，E，G）不同浓度DNA作用下的ONRPA、outer-RPA和inner-RPA的荧光光谱分析。（D、F、H）荧光强度与时间之间的一阶导数的结果，这个实验进行了三次。

巢式PCR与CRISPR/Cas12a联用的性能

图注：2.169×10¹copies·μL⁻¹和2.169×10³copies·μL⁻¹浓度下的内部PCR、外部PCR和巢式PCR的比较。实验进行了三次。

图注：(A)和(B) ONRPA 和巢式PCR与CRISPR/Cas12a结合的方案。(C, E)不同浓度DNA的内部PCR和巢式PCR的荧光光谱。(D, F)荧光强度与浓度对数的关系，实验进行了三次。

总结

此次研究基于先达基因研发的ERA超增技术（酶促恒温扩增技术)和CRISPR/Cas12a的基础上，开发一种新型的单管嵌套重组酶聚合酶扩增(ONRPA)技术。该ONRPA技术打破了扩增的平台期期，大大提高了信号的灵敏度，消除了灰色区域的问题。ONRPA技术接连使用两对引物，降低了放大多个目标区的概率，完全不受非特异性扩增的污染，从而提高了精确度，这在核酸检测中非常重要。最后，通过 CRISPR/Cas12a 系统作为终端输出，该方法在32分钟内实现了低至2.169copies·μL⁻¹ 的高信号输出。ONRPA的灵敏度是传统RPA的100倍，是qPCR的1000倍。ONRPA与CRISPR/Cas12a的结合将成为临床应用中RPA的一种重要的新启动子。