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对虾肝肠孢子虫(EHP)核酸检测试剂盒使用说明书


先达基因 / 2021-10-15


对虾肝肠孢子虫(EHP)核酸检测试剂盒使用说明书

(产品货号:KW112


试剂盒标配材料


 

组分

24T

96T

溶解剂 DA (白   

1.2mL

1.2mL*2

激活剂 MC 绿盖

250μl

250μl

阳性质控  (红盖

80μl

80μl

荧光检测试剂 (铝箔袋)

24T*1

24T*4

使用说明书

1

1

检测下限

本试剂盒最低检测下限为100-1000copies/测试

存储条件及有效期

存储在-20±5℃、干燥、避光的环境,有效期1年。


详细实验方案(反应体系为 50μl

1.按照以下所述制备每份样本的预混液:

组分

每管加样量/μl

溶解剂[1]

20

模板DNA

2x10

ddH2O

28-x

体积

48

充分振荡混匀并短暂离心。

2. 对于每份样本,将48μl预混液转移至每管荧光检测试剂[2]中。振荡混匀[3]直到扩增试剂重悬,并短暂离心。

3. 对于每份样本,在反应管盖上加上2μl激活剂[4],小心盖紧管盖,通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀[5]并再次快速离心。

4. 将反应管放入恒温仪(40℃)中,启动检测,持续20分钟,每30秒采集一次FAM通道荧光值。

5. 反应结束后,保存数据并弃置样本管。

操作注意要点:

[1] 溶解剂需完全融化混匀,否则会对实验产生影响。

[2] 荧光扩增试剂在使用前放置室温平衡10min,剩余未用尽的试剂应注意防潮密封保存

[3] 此处振荡混匀旨在将扩增试剂重悬,使体系分散均匀,混匀时间应在3-5s3000rpm

[4] ERA反应是靠激活剂来启动,一旦加入激活剂,务必立即上机孵育

[5] 此处振荡混匀时间应在3s左右,时间过长会导致检出时间延后。

 

阳性对照反应

核酸检测试剂盒包括阳性质控(浓度:105cp/μl),可用于检测试剂盒各组分的活性。检测方法与上述实验方案相同,反应温度推荐使用40。本荧光检测试剂中含探针,并带有荧光素(FAM)标记物,最佳激发波长为492nm,最大发射波长为520nm

注:如使用ABI系列PCR仪,请务必于passive referencequencher处均选择“none”。



 
 

结果判定

检测结果曲线为直线或轻微斜线,无“S”型扩增曲线,可报告样品阴性,不含有检测项目核酸成分或含量低于检测限;检测结果曲线呈“S”型扩增曲线,可直接报告样品阳性,含有检测项目核酸成分;NG反应为平滑直线,PG 反应为“S”型扩增曲线,此次检测结果有效,否则无效。

 

注意事项

1. 本试剂盒仅用于非医用检测;应存储于-20±5℃、干燥、避光的环境。

2. 推荐使用先达基因核酸释放剂(目录号:NR201):取芝麻大小动物组织(约15mg),加入到150μl核酸释放剂中,振荡混匀,95℃水浴2min后轻微振荡混匀,快速离心以备下用。或采用DNA抽提试剂盒等方式提取核酸。

3. ERA扩增产物的气溶胶易造成假阳性,为避免交叉污染,试剂配制区与扩增分析区应分隔开。

4. 实验时应设置不加模板的空白对照,以确认是否有待扩增核酸的污染。

5. 在不同的核酸提取方法下,所提取的样本DNA含量和纯度会有差异,可能会导致出现扩增效率不一的现象(详情请查阅PCR抑制剂:乙醇、苯酚、血红素等等)。

6. 阳性质控建议添加2μl,待检样本添加量范围为2μl~10μl。如果待检样本浓度较高,则仅需添加2μl,反之,则加大样本添加量,最大体积不超过10μl。

7. 如果模板DNA拷贝数低,请在反应4分钟后取出反应管,振荡混匀并短暂离心,再放回恒温仪中。


8. 任何能激发和检测所选荧光团,并能将温度稳定于40℃的荧光检测仪都适用于荧光探针检测(GS8荧光恒温扩增仪,ABI 7500,LightCycler480,CFX 96等荧光定量PCR仪)。


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