支原体检测试剂盒使用说明书

（产品货号：KS201）

试剂盒标配材料 

    本试剂盒最低检测下限为50copies/测试

存储在-20±5℃、干燥、避光的环境，有效期1年。

详细实验方案（反应体系为 50μl）

1. 按照以下所述制备每份样本的预混液：

       组分

    溶解剂

    模板DNA

    ddH₂O

充分振荡混匀并短暂离心。

2. 对于每份样本，将48μl预混液转移至每管检测扩增试剂^[2]中。振荡混匀^[3]直到扩增试剂重悬，并短暂离心。

3. 对于每份样本，在反应管盖上加上2μl激活剂^[4]，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀^[5]并再次快速离心。

4. 将反应管放入恒温仪（40℃）中，启动检测，持续25分钟，每30秒采集一次FAM通道荧光值。

5. 反应结束后，保存数据并弃置样本管。

操作注意要点：

[1] 溶解剂需完全融化混匀，否则会对实验产生影响。

[2] 荧光扩增试剂在使用前放置室温平衡10min，剩余未用尽的试剂应注意防潮密封保存。

[3] 此处振荡混匀旨在将扩增试剂重悬，使体系分散均匀，混匀时间应在3-5s，3000rpm。

[4] ERA反应是靠激活剂来启动，一旦加入激活剂，务必立即上机孵育。

[5] 此处振荡混匀时间应在3s左右，时间过长会导致检出时间延后。

阳性对照反应

支原体检测试剂盒包括支原体阳性质控（浓度：10⁵cp/μl），可用于检测试剂盒各组分的活性。检测方法与上述实验方案相同，反应温度推荐使用40℃。支原体荧光检测试剂中含探针，并带有荧光素（FAM）标记物，最佳激发波长为492nm，最大发射波长为520nm。

注：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。

注意事项

检测结果曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有支原体成分或含量低于检测限；检测结果曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有支原体成分；NG反应为平滑直线，PG 反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。

注意事项

1. 本试剂盒仅用于非医用检测；应存储于-20±5℃、干燥、避光的环境。

2. 推荐样品制备方案：取500μl 细胞上清液（或上述细胞悬浮液），14000rpm离心6min，去除上清收集沉淀（注意：可用吸头吸净上清），再加入50μl无菌水，振荡混匀，95℃水浴3min后轻微振荡混匀，快速离心以备用。

3. ERA扩增产物的气溶胶易造成假阳性，为避免交叉污染，试剂配制区与扩增分析区应分隔开。

4. 实验时应设置不加模板的空白对照，以确认是否有待扩增核酸的污染。

5. 在不同的核酸提取方法下，所提取的样本DNA含量和纯度会有差异，可能会导致出现扩增效率不一的现象（详情请查阅PCR抑制剂：乙醇、苯酚、血红素等等）。

6. 支原体阳性质控建议添加2μl，待检样本添加量范围为2μl~10μl。如果待检样本浓度较高，则仅需添加2μl，反之，则加大样本添加量，最大体积不超过10μl。

7. 如果模板DNA拷贝数低，请在反应4分钟后取出反应管，振荡混匀并短暂离心，再放回恒温仪中。

8. 任何能激发和检测所选荧光团，并能将温度稳定于40℃的荧光检测仪都适用于荧光探针检测（GS8荧光恒温扩增仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光定量PCR仪）。

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