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RT-基础型核酸扩增试剂盒(ERA法)使用说明书


先达基因 / 2021-01-05



RT-基础型核酸扩增试剂盒(ERA法)使用说明书

(产品货号:KS102

试剂盒标配材料

组分

24T

96T

溶解剂 DA (白

1.2mL

1.2mL*2

激活剂 MC 绿盖

250μl

250μl

阳性引物 PM

180μl

180μl

阳性标准品红盖

80μl

80μl

6* Loading Buffer(紫盖)

1mL

1mL

RT-基础扩增试剂(铝箔袋)

24T*1

24T*4

使用说明书

1

1

检测下限

本试剂盒最低检测下限为10-100copies/测试(依据引物筛选优化程度和检测手段)

存储条件及有效期

存储在-20±5℃、干燥、避光的环境,有效期1年。

详细实验方案(反应体系为 50μl

1. 按照以下所述制备每份样本的预混液:

组分

每管加样量/μl

溶解剂[1]

20

正向引物 (10μM)

2.5

反向引物 (10μM)

2.5

模板RNA

2x10

ddH2O

23-x

体积

48

充分振荡混匀并短暂离心。

2. 对于每份样本,将48μl预混液转移至每管RT-基础扩增试剂[2]中。振荡混匀[3]直到扩增试剂重悬,并短暂离心。

3. 对于每份样本,在反应管盖上加上2μl激活剂[4],小心盖紧管盖,通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀[5]并再次快速离心。

4. 将反应管放入恒温仪(40-42℃)中孵育20分钟。

5. 孵育结束后[6]应立即使用产品自带6*Loading Buffer,按所需量(每10μl样品加1.5μl Loading Buffer)添加后,56孵育5分钟,然后在琼脂糖凝胶上跑胶,或纯化ERA扩增产物[7]进行其他下游应用


操作注意要点:

[1] 溶解剂需完全融化混匀,否则会对实验产生影响。

[2] RT-基础扩增试剂在使用前放置室温平衡10min,剩余未用尽的试剂应注意防潮密封保存

[3] 此处振荡混匀旨在将扩增试剂重悬,使体系分散均匀,混匀时间应在3-5s3000rpm

[4] ERA反应是靠激活剂来启动,一旦加入激活剂,务必立即上机孵育

[5] 此处振荡混匀时间应在3s左右,时间过长会导致检出时间延后。

[6] 孵育结束后必须立即终止反应【纯化或者使用蛋白酶K5μg/100μl消化处理】,否则反应会继续进行,产生大量非特异性扩增,影响实验结果。

[7] ERA是一类多酶反应体系(即酶促重组等温扩增技术),若不做纯化直接跑核酸电泳胶,会堵塞胶孔,核酸无法跑出


阳性对照反应


RT-基础型核酸扩增试剂盒包括阳性引物和阳性标准品(浓度:108cp/μl),可用于检测试剂盒各组分的活性。检测方法与上述实验方案相同(阳性引物Primer mix添加量为4μl),反应温度推荐使用40。阳性对照反应可生成172碱基对组成的扩增产物,凝胶电泳时将出现相应条带。



注意事项


1. 本试剂盒仅用于非医用检测;应存储于-20±5℃、干燥、避光的环境。

2. ERA扩增产物的气溶胶易造成假阳性,为避免交叉污染,试剂配制区与扩增分析区应分隔开。

3. 实验时应设置不加模板的空白对照,以确认是否有待扩增核酸的污染。

4. 在不同的核酸提取方法下,所提取的样本RNA含量和纯度会有差异,可能会导致出现扩增效率不一的现象(详情请查阅PCR抑制剂:乙醇、苯酚、血红素等等)。

5. 阳性标准品建议添加2μl,待检样本添加量范围为2μl~10μl。如果待检样本浓度较高,则仅需添加2μl,反之,则加大样本添加量,最大体积不超过10μl。

6. 单独添加模板RNA至反应管盖时,应与激活剂分开,防止与激活剂混合后稳固RNA的三级结构,从而导致逆转录酶受到抑制。

7. 如果模板RNA拷贝数低,请在反应5分钟后取出反应管,振荡混匀并短暂离心,再放回恒温仪中。

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