【ERA技术】

通过模拟生物体遗传物质自身扩增复制的原理，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进行改造突变并筛选其功能，通过不同的核酸扩增反应体系进行优化组合，从而获得核心的重组等温扩增体系，在37-42℃恒温条件下，可将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增数十亿倍，即（酶促重组等温扩增，Enzymatic Recombinase Amplification）ERA技术方法。

1、ERA扩增试剂盒应在怎样的温度下使用？

标准的ERA扩增试剂盒经过配制可在37℃-42℃的温度范围内操作。过高的温度会对反应体系产生不利的影响，因为酶会逐渐地失去全部活性。对于RT试剂盒，我们建议客户在40℃下运行反应，因为逆转录酶在稍高温度下具有更高的活性。

2、经过一种ERA扩增试剂盒测试过的引物，能直接用于其他ERA扩增试剂盒吗？

不一定。如果您已设计筛选出ERA基础型核酸扩增试剂盒的引物，用于ERA荧光型或ERA试纸型核酸扩增试剂盒时还需要引入探针。这个意味着跑胶检测、荧光检测或是测流层析检测对引物的最佳组合可能有着不同的要求。通常情况下，使用相同的引物探针从ERA荧光型转为ERA试纸型能获得相当可靠的结果，此时ERA试纸型荧光信号强度会大幅度减弱，但不会影响灵敏度检测。荧光检测的最佳引物/探针组合不一定是跑胶检测的最佳引物组合，反之亦然。从DNA检测分析转为RNA检测的逆转录分析情况更复杂，因为逆转录酶对引物有着不同的偏好。就这一点而论，我们建议使用RT试剂盒在RNA模板上设计RNA检测，而不是使用DNA试剂盒优化后的结果尝试转为使用RT试剂盒。

3、当我向扩增试剂中加入事先配制好的预混液时，扩增试剂变浑浊，这有问题吗？

这对于ERA反应来说属于正常现象，没有问题。ERA反应会形成乳状液，有时肉眼可观察到此变化。

4、可以保存ERA扩增反应产物吗？

可以，基础型、RT-基础型、试纸型或是RT-试纸型反应体系的扩增产物短期可以保存在4℃下，长期保存建议-20℃。但荧光型（RT）扩增产物不能保存。如果在反应结束后未经迅速失活处理，核酸酶会逐渐消化扩增产物。

5、可以对EAR扩增反应进行终点分析吗？

可以，但不包括荧光型（RT）试剂盒。因为在反应结束后，未经迅速失活处理，核酸酶会逐渐消化扩增产物。要分析扩增产物，请使用基础型（RT）或试纸型试剂盒进行跑胶检测分析。

6、可以将激活剂添加至重悬试剂中吗？

如果您在使用基础型（RT）、试纸型（RT）反应体系时，是可以添加的。

不过一旦加入激活剂，反应体系立即被启动。在最后添加激活剂时，我们建议将激活剂添加到8联排反应管的盖子上，并将其离心至反应体系中，这样便可确保反应同时开始。

如果您在使用荧光型（RT）反应体系时，是不可以添加的。当体系里面有激活剂存在时，引物和探针会受到核酸酶的破坏，便会导致反应中出现很高的荧光基线。

7、可以在反应体系中加入更多/更少的溶解剂吗？

不可以。加入比建议更多或更少的溶解剂会对ERA反应的进行方式产生不利的影响。溶解剂中包含ERA反应所需的成分，因此加入更多或更少的溶解剂将会改变其在重悬试剂中的最终浓度。

8、可以制备预混液吗？

可以。如果您想建立多个反应，可以制备预混液。在筛选不同的DNA时，可以将溶解剂、引物和探针（如果使用）混合在一起，并加到扩增试剂中重悬。然后将不同的DNA加入反应体系，最后照常激活剂启动反应。在筛选不同引物时，可以将溶解剂、模板DNA、探针（如果使用）和一个引物制成预混液，并将其分装到1.5ml小管后再分别加入不同的引物。只有当两个引物都存在时，才能重悬扩增试剂，否则会使重组复合物的形成偏向先添加的引物。

9、跑胶之前需要纯化EAR扩增产物吗？

需要。ERA反应体系里的所含试剂和蛋白会干扰正常的琼脂糖凝胶电泳，如果不进行产物纯化，跑出来的可能是弥散条带而不是干净的条带。

10、如果要运行ERA反应，需要哪种类型的仪器设备？

本公司有一款自主开发的GS8恒温荧光检测仪，简单便携。基础型（RT）和试纸型（RT）适用于任何能保持37-42℃的稳定温度的设备。对于使用荧光型（RT）试剂盒进行实时反应时，可使用能激发并检测所用荧光基团（最佳激发波长为492nM，最大发射波长为520nM）并能保持37-42℃稳定温度的仪器设备或实时热循环仪，注意，在运行ERA反应时，盖加热功能应关闭。这里推荐使用本公司自主开发的GS8恒温荧光检测仪，简单便携。也可使用ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光定量PCR仪。

11、使用ERA扩增试剂时，我可以如何提高一致性和改善RNA靶基因的扩增？

如果模板RNA在添加到反应之前先与激活剂合并，这可能使RNA的三级结构稳定化，从而导致逆转录酶受到抑制。现将模板RNA添加到反应混合液中再添加激活剂，或相隔一段距离（即RNA与激活剂分别添加到反应盖子的相对两侧）同时添加，这样可提高性能。

12、出现假阳性的结果，可能的原因有哪些？

如果在无模板对照中观察到假阳性结果，可能的原因主要有污染或引物设计引起。

1）通常由污染引起比较多见，现象为无模板对照或阴性对照的检测结果显示与阳性结果非常类似。以荧光检测为例，具有扩增曲线，荧光值较高一般为阳性值相差不大。对此，我们建议区分试剂配制区和扩增分析区。在使用任何扩增后打开反应管的终点检测方法时，必须采用严格的污染控制措施。要排除或清除污染，我们建议用消毒液或75%的酒精对工作区域进行消毒，并使用新的扩增试剂（溶解剂、激活剂等）。可能需要重复几次清洁，才能彻底清除污染。

2）引物设计问题导致，现象为无模板对照或阴性对照的检测结果显示与阳性结果有较大的差异。以新冠检测为例，一般出峰时间较晚（在13分钟以后），荧光Δ值较低，扩增曲线不明显。针对此类问题，我们建议引物进行重新设计和筛选。

13、在荧光型（RT）反应即将结束时，有时会看到荧光急剧增强，这正常吗？

正常。在荧光（RT）反应中，聚合酶和核酸酶处于竞争关系。随着反应的能量逐渐耗尽，结果导致探针更快地裂解和荧光信号出现剧增。

14、在用测流层析试纸进行检测之前需要稀释ERA扩增产物吗？

需要。ERA反应体系里的试剂和蛋白会干扰测流层析试纸上的抗体，如果不进行充分稀释就会出现非特异性结合和假阳性信号。

15、试剂盒在运输时处于室温，它还能使用吗？

可以，试剂盒处于室温下3天不会有问题，仍然可以使用。对于长期储存，我们建议储存在-20℃。

16、ERA引物需要多长？

为了充分利用ERA的检测速度和灵敏度，我们建议客户使用29-32个核苷酸长度的引物。通常情况下，PCR引物可用于ERA反应体系，但这类引物的检测速度和灵敏度可能不及较长的引物。

17、ERA引物应当相距多远？

一般而言，我们建议两个ERA引物产生的扩增片段不应超过300bp。ERA扩增片段的大小或许没有下限，不过根据ERA引物最小长度，扩增片段的大小最小约80bp。为了获得最快的检测速度，最终的扩增片段长度应为100-200bp。

18、我需要筛选多少引物？

这取决于您对检测灵敏度的要求。举例来说，如果您只需要每个反应检测1000个分子或以上，那么大多数引物对都够用了。对于极高灵敏度的检测，最好是进行系统性的引物筛选以找到好的ERA引物。最初筛选时，测试的引物条数通常是正反向引物各7条。测试的引物越多，找到能够检测单个分子的好引物对的几率就越大。

19、我该如何选择探针？

如果使用适用于探针的其中一种试剂盒，需要注意的是，在标靶区域选择探针位置时，有一些序列限制。如果存在不合理的限制，本公司可帮助您设计备选检测方案。

20、我如何配制冻干引物、探针？

通常，用TE（10mM Tris-Hcl pH8.0 0.1mM EDTA）来制备100μM的储存溶液，并长期储存于-20℃。

21、GS8的荧光强度检测重复性的变异系数和荧光强度检测精密度的变异系数还有反应灵敏度能查到吗？

我们出厂有一定测试设定，重复性cv<=5%。

荧光精密度主要是一个变化参数，一般pcr仪器都是测试的荧光变化值。我们根据试剂反应功能测试。

灵敏度也是参考试剂而定，一般仪器和灵敏度无关。

22、ERA试剂是否可以用于SHERLOCK或DETECTR实验？

ERA试剂可以用于SHERLOCK或DETECTR实验方法。根据经验SHERLOCK或DETECTR方法对盐离子浓度比较敏感，盐离子浓度差异对结果影响较大，所以在使用过程中需要对反应体系中盐离子浓度进行适当优化。建议利用KOAc进行盐离子增补优化。

苏州先达基因（www.gendx.cn）的具有全球自主知识产权的酶促重组扩增技术（ERA技术） （申请号：PCT201910262085.3） ，可实现在37~42℃恒温条件下，10-15分钟，将靶DNA/RNA特异性扩增数十亿倍。