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三种快速支原体检测试剂盒检测原理与优缺点比较


先达基因 / 2020-06-05

 在细胞培养,特别是传代细胞培养中,支原体污染率达到15-35%。支原体的侵染会引起细胞功能和基因表达的严重改变,并造成持续危害。由于支原体污染会严重影响实验结果的可靠性、重复性和一致性,对支原体的常规检测非常重要。

传统的支原体检测方法很耗费时间,通常需要一天至数周,而且操作比较繁琐,准确度不高。

中国药典给定的支原体标准检测方法有两种:培养法和DNA染色法。培养法方法简单,假阳性率低,但样品需要量高,耗时20天左右,时间漫长。DNA染色法结果直观,假阳性率低,但需要荧光显微设备,实验操作复杂。

能否找到一种省时、省力且准确性高的方法检测支原体污染呢?

目前,市场上具有多款支原体快速检测试剂盒,我们选取了其中3种品牌的快速支原体检测试剂盒,就其检测原理与优缺点进行一下比较。

一、美国CLARK Bioscience品牌一步法检测试剂盒

美国CLARK Bioscience公司研发的一步法支原体检测试剂盒One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit,利用等温扩增的方法,可检测7种常见支原体的基因。

该检测方法与PCR方法类似,检测过程中,只需取少量细胞培养上清,及一个能控制温度的水浴锅或恒温金属浴,其扩增产物的颜色可通过肉眼直接观察判断,整个过程需要1小时左右。

该方法对仪器的要求比较低,理论上灵敏度比较高。缺点在于检测的支原体种类太少,目前已发现的近200种支原体,只能检测其中的7种,检测范围太窄,也不符合国家药典的规定。而且肉眼观察结果比较主观,有可能不同的实验人员判读的结果不一致。

二、美国Lonza品牌生物发光法检测试剂盒

美国Lonza品牌的MycoAlertTM 和升级的MycoAlertTM PLUS支原体检测试剂盒,采用生物发光的方法,检测支原体酶活性。其检测的支原体酶广泛存在于180多种支原体中,而不存在于真核细胞中。

该方法利用支原体酶的特定活性,进行选择性的生物化学检测。当支原体被溶解后,释放的酶与支原体检测试剂盒中提供的底物发生催化反应,将ADP转化成ATP,参与生物发光反应,并可通过分光光度计测定。如果样品添加底物后读数上升,表明存在支原体污染。整个实验过程需要20分钟左右。

该方法能够检测的支原体种类比较全,检测结果量化,容易判断,耗时短。缺点是需要配置发光仪或多功能酶标仪,知名度不如扩增法,灵敏度也可能低于扩增法。

三、苏州先达基因支原体检测试剂盒

我国苏州先达基因研发了一种细胞污染支原体检测试剂盒,从样本处理到读取检测结果只需30分钟左右。检测范围涵盖130种支原体。

其原理是基于该公司自主开发的实时荧光恒温核酸检测技术ERA),该技术可以在恒定的低温下(25-42℃)对痕量的支原体种内保守性DNA片段进行特异性的扩增,样本的处理只需吸取200微升的细胞悬95℃水浴2分钟作为模板,反应体系需置于荧光定量检测仪中进行,设置温度为37℃,扩增反应可以在20分钟内完成,观察荧光定量检测仪显示的扩增曲线判读检测结果。

该方法利用了一种恒温核酸扩增方法,灵敏度比PCR10-100倍,可以在恒定的低温条件下进行,而且用时在30分钟以内,并且检测范围涵盖130种支原体,是一种比较理想的支原体检测方法。缺点是该试剂盒需要借助荧光定量检测仪,仪器往往比较昂贵,不过先达基因推出了专用的荧光定量检测仪,该方法对温度控制元件要求不高,所以该仪器相对比较便宜而且小巧。


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