一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。细胞培养中的急性污染往往容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染。据统计，超过25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。早期，血清可能是主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂渐渐蔓延开来，细胞无不中招。怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？

支原体生长缓慢，通常不破坏宿主细胞。然而，它们能以许多不同方式改变细胞的新陈代谢。细胞除了长得不好之外，几乎所有的实验表现如蛋白表达也都会受到影响。传统的抗生素对支原体并不奏效，因为它们大多破坏细胞壁的完整性，而支原体恰恰没有细胞壁。这也就是支原体感染率高的主要原因。曾有一位细胞培养专家戏称：“我可是支原体方面的专家，并不是因为我喜欢他们，而是25-60%的细胞系都感染了支原体。”支原体总在偷偷地改变细胞，篡改我们的实验数据。怎么办？

检测、检测、再检测

对培养物进行常规的支原体检测非常重要。尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。比如美国国立细胞培养中心（NCCC），它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明无支原体污染。一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。

检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。到底是PCR、生化分析、ELISA还是免疫荧光呢？PCR应该算是检测支原体的理想方法，它综合了几个优势：灵敏、特异、快速、廉价等。细胞培养上清可直接用来检测，非常方便。Sigma-Aldrich公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，扩增的就是支原体基因组上16S核糖体RNA基因。此区域高度保守，因此可检测多达19种支原体。当然，为了避免假阳性和假阴性，实验中必须设立多种对照：阳性对照、阴性对照和内对照。如果电泳图上出现259bp的清晰条带，对不起，你中招了。以色列Biological Industries（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit也能提供支原体的快速检测，引物与Sigma类似，也是扩增16S rRNA。这个试剂盒的灵敏度颇高，M. capricolum的检测极限为5.5 CFU/ml，M. hyorhinis则为10.5 CFU/ml。

Stratagene新的MycoSensor QPCR Assay Kit通过实时定量PCR的方法来检测最低10个拷贝的支原体，连跑胶的时间都省了，整个过程只需要2小时。阳性PCR产物的Tm值为85C，而内对照为82C，通过熔解曲线分析能将两者区分开。另外，Stratagene也提供了PCR检测支原体的试剂盒。

如果你对杂交过程得心应手，还可以选择R&D公司的MycoProbe Mycoplasma Detection Kit。它利用标记了碱性磷酸酶的寡核苷酸探针与16S 核糖体RNA杂交，随后用显色底物就能了解支原体的存在。整个过程只需4.5小时，也还算快，能检测8种最常见的支原体。

用Hoechst 33258染料检测支原体是很多教科书推荐的方法。由于支原体含有DNA，能与Hoechst 33258染料结合，在500倍放大情况下，表现为细小颗粒或纤毛染色。但操作过程较繁琐，且需要一定的经验来辨别支原体，新手可能不大容易掌握。

特别值得一提的是，我们苏州先达基因公司研发的支原体检测试剂盒，其原理是基于公司自主开发的实时荧光恒温核酸检测技术（ERA），可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体，灵敏度也比较高，是普通PCR的10-1000倍，操作简便。

不过，预防支原体的最佳方法还是良好的细胞培养技巧和正确的态度。虽然这些都是老生常谈，但一旦熟悉了细胞培养，就很容易麻痹大意，时常敲敲警钟还是相当必要的。